مقاله با موضوع استانداردها و تحلیل داده

دانلود پایان نامه

ژل‌ها پس از رنگ‌بری مناسب در اسیداستیک 3 درصد در دمای آزمایشگاه نگهداری شدند. این ژل‌ها آماده عکس‌ برداری و تفسیر بودند که در فصل چهارم نتایج خواهد آمد.


3-5-2 طرزتهیه مارکر
مارکر مورد استفاده حاوی Tetramer Albumin Bovine(وزن مولکولی 272 کیلو دالتون)، Dimer Albumin Bovineh(وزن مولکولی 132 کیلو دالتون)، Albumin Egg(وزن مولکولی 45 کیلو دالتون)، Carbonic Anhydrase(وزن مولکولی 29 کیلو دالتون) بود.
همگی باهم مخلوط گردیدند و محلول بدست آمده را با همان مقدار بیس بافر مخلوط کردیم. و به مدت 3 دقیقه در حال جوش در دمای oC 110 در بن‌ماری قرار دادیم و بعد از مدتی که هم دما با محیط شدند قابل لود کردن در چاهک می‌باشد که به میزان 30 میکرولیتر لود گردید. استانداردهای وزنی و نمونه‌های مورد مطالعه را در شرایط یکسان الکتروفورز کرده و پس از اتمام SDS-PAGEژل را رنگ‌آمیزی نمودیم.
د: تعیین وزن ملکولی پروتئین‌های مجهول
سدیم‌ دودسیل‌ سولفات درحضور ماده احیاء کننده و حرارت به سراسر زنجیره‌های پلی‌پپتیدی وصل می‌شود. مقدار SDS که به هر زنجیره پلی‌پپتیدی متصل می‌گردد، متناسب با وزن ملکولی (mw) پلی‌پپتید است. مجموعه‌های پلی پپتیدی SDS حاصله که تراکم بار الکتریکی مشابهی دارند در ژل پلی‌اکریل‌آمید بر اساس وزن ملکولی خود حرکت می‌کنند. تحت چنین شرایطی مسافت نسبی طی شده توسط پروتئین‌ها با لگاریتم وزن ملکولی آنها رابطه خطی دارد. بنابراین اگر چند پروتئین شناخته شده به عنوان استانداردهای وزنی در دسترس باشد می‌توان وزن ملکولی پروتئین‌های مورد مطالعه را بر اساس آنها تخمین زد.
3-6 روش کار:
استاندارد‌های وزنی و نمونه‌های مورد مطالعه را در شرایط یکسان الکتروفورز کرده و پس ازاتمام SDS-PAGE ژل را رنگ‌آمیزی نمائید.
فاصله رنگ نشانگر (برموفنل بلو) و باندهای پروتئینی (لبه جلویی هر باند) را از ابتدای ژل جدا کننده اندازه‌گیری نموده، سپس حرکت نسبی هر پروتئین را RF را می‌توان از روی تصویر ژل نیز تعیین کرد‏.
با توجه به اطلاعات مربوط به وزن مولکولی وRF پروتئین‌های استاندارد، منحنی استاندارد روی کاغذ نیمه لگاریتمی رسم شد. محور لگاریتمی کاغذ به وزن ملکولی اختصاص دارد. وزن ملکولی پروتئین‌های مورد مطالعه از روی منحنی استاندارد محاسبه شد. در حال حاظر انواعی از استانداردهای وزنی توسط شرکت‌های مختلف عرضه می‌شود. بعضی از این استانداردها رنگی بوده، بدون رنگ‌آمیزی قابل تشخیص هستند. انتخاب نوع استاندارد بایستی با توجه به محدوده وزنی پروتئین‌های مورد مطالعه و غلظت ژل پلی‌اکریل‌آمید (غلظت ثابت یا شیب غلظت) صورت گیرد. قابل توجه است که در هر ژل، با غلظت ثابت، رابطهRF و وزن مولکولی در محدوده کوچکی به صورت خطی بوده در این محدوده تخمین وزن مولکولی دقیق‌تر است. بنابراین بهتر است در ژل با درصد ثابت از استانداردهایی با وزن ملکولی پایین (LMW)، متوسط (MMW) یابالا (HMW) استفاده شود.
استفاده از استانداردهای وزنی با طیف گسترده در ژل با غلظت ثابت مناسب نیست چرا که اغلب اجزاء این نوع استاندارد، در رسم منحنی استاندارد و تعیین وزن ملکولی شرکت ندارند. استانداردهای وزنی با طیف گسترده برای ژل‌های دارای شیب غلظت اکریل‌آمید مطلوب هستند.
3-7 روش‌های آماری مورد استفاده
اطلاعات حاصل از پروتیینهای کل به صورت باند های مجزای پروتئینی برای بذور مختلف روی صفحه ژل پلی اکریل آمید نمایان گردید. جایگاه هر یک از این باند ها از طریق حرکت نسبی (Relation Mobility) آنها مشخص و به صورت اعداد کمی بیان گردید. بر اساس وجود (عدد یک) یا عدم وجود هر باند (عدد صفر) در فواصل مختلف، نسبت به تشکیل ماتریس داده ها اقدام گردید.
میانگین تعداد باند‌ها (Na)، تعداد باندهای با فراوانی مساوی یا بیش از 25% و 50%، باندهای نادر (با فراوانی کمتر از 5%)و هتروزیگوسیتی با نرم‌افزار GeneAlex (Peakal و Smouse، 2006) محاسبه گردید. تسهیم گوناگونی ژنتیکی درون و میان گروهی توسط آزمون واریانس ملکولی (AMOVA؛Excoffier و همکاران، 1992) و برنامه نرم افزاری (ARLEQUIN 1.1؛Schnieder و همکاران، 1997) تعیین شد. اهمیت هر جزء واریانس با آزمون permutation (Excoffier و همکاران، 1992) مطالعه شد. فاصله ژنتیکی میان جمعیتهای مختلف بر اساس معادله Nei (1978) برآورد شد. از آزمون Neighbor-Joining بانرم‌افزارMEGA (Tamura و همکاران، 2007) و روش تجزیه به مولفه‌های اصلی (Gower، 1966) برای تفسیر ماتریکس فاصله ژنتیکی استفاده شد.به منظور تعیین رابطه همبستگی بین جفت فواصل ژنتیکی، مرفولوژیکی و جغرافیایی از آزمون Mantel (1967) و نرم‌افزارGeneAlex (Peakal & Smouse, 2006) استفاده گردید. برای مطالعه رابطه بین ویژگیهای ژنتیکی، صفات مورفولوژی و جوانه‌زنی و مشخصات آب و هوایی و منطقه‌ای از روش پیرسون با استفاده از نرم افزازSpss19استفاده شد.

فصل چهارم
تجزیه و تحلیل داده ها

4-1- بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای علف گندمی بر اساس صفات مورفولوژیکی