مقاله با موضوع روشهای آماری و مورفولوژی

دانلود پایان نامه

مکانیسم عمل تثبیت کننده: قبل از رنگ‌آمیزی ژل لازم است پروتئین‌ها، تثبیت شوند تثبیت پروتئین دو نقش دارد: 1) پروتئین‌ها را در ژل ثابت نگه داشته و انتشار آنها را در ژل به تاخیر می‌اندازد. 2) موادی که ممکن است با مراحل رنگ‌آمیزی تداخل کند مثل پاک کننده‌ها، گلیسین و…را حذف می‌کند. تثبیت کننده‌هایی که معمولا مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از: گلوترالدئید، اتانول، متانول، اسید استیک و تری کلرواستیک اسید (T.C.A) (Dunn، 1993)‏.
رنگ کردن: پس از تثبیت، رنگ‌آمیزی ژل اکریل‌آمید با کوماسی‌بلو انجام می‌شود. رنگ‌آمیزی با این ماده آسان بوده و قادر است باندهای بسیار کوچک را آشکار نماید. لازم به ذکر است که رنگ‌آمیزی باکوماسی بلو نیاز به محیط اسیدی برای جاذبه الکتروستایک دارد تا بین ملکول‌های رنگ در گروه‌های آمینو پروتئین‌ها اعمال کند. این جاذبه یونی باعث تشکیل رنگ پروتئین می‌شود. مطالعات در مورد مکانیسم عمل این رنگ نشان داده است که همبستگی معنی‌داری بین میزان رنگ و باقی مانده اسیدهای لیزین، هیستدین و آرژنین در پروتئین وجود دارد. حداقل زمانی که برای رنگ‌آمیزی لازم است بستگی به ضخامت ژل و غلظت ژل دارد، هر چه ضخامت ژل و غلظت ژل بیشتر باشد مدت زمان لازم افزایش می‌یابد (Hames وRickwood، 1981)‏.
شناسایی باند‌ها: پس از رنگ کردن و آشکار سازی پروتئین‌ها، باندهای حاصله را برحسب فاصله‌ای که از بالای ژل دارند و اصطلاحا تحرک نسبی خوانده می‌شود، شناسایی می‌کنند.
مسافتی که پروتئین در ژل زیرین حرکت کرده است تقسیم بر مسافتی که رنگ در ژل زیرین حرکت کرده
Dunn.1933

از آنجا که پروتئین‌ها به عنوان محصولات مستقیم ژن‌ها شناخته می‌شوند، انتظار می‌رود افرادی که از لحاظ ژنتیکی به یکدیگر نزدیک هستند، باندهای مشابهی را تولید کنند. برای بررسی شباهت‌های بین یک جمعیت با استفاده از این باندها از ضرایب زیر استفاده می‌شود:
تشابه اندیس از فرمول محاسبه میشود.
که در آن w تعداد باندهای مشابه در دو گونه aتعداد باندهای مشاهده شده در گونه اول وb تعداد باندهای مشاهده شده در گونه دوم‏.
ضریب تشابه از فرمول محاسبه می شود که در آن aتعداد باند‌های مشابه در دو گونه، b تعداد باندهای منحصر به گونه دوم‏.
ضریب رابطه یa+bنمونه هااز فرمول محاسبه می شود. که در آن d نشانگر تعداد باندهایی است که در گونه مورد مقایسه وجود ندارد (مقدم و همکاران، 1373)‏.
2-3-5 استفاده از الکتروفورز در بررسی تنوع ژنتیکی
الکتروفورز پروتئین‌ها برای جمع‌آوری و ایجاد داده‌های سیستماتیک از ماکروملکول‌ها روشی است که بصورت وسیع مورد استفاده قرار می‌گیرد و به صورتی فزاینده در بین متخصصین سیستماتیک گیاهی محبوبیت یافته است (رحیمی نژاد، 1378)‏.
2-3-5-1 الکتروفورز پروتئین‌ها
تصور بر این است که این الگوها باید نمایشگر معیاری از تشابهات و اختلافات وراثتی در بین گیاهانی که بایکدیگر مقایسه می‌شوند باشند. استفاده از الگوهای پروتئینی در مطالعات سیستماتیک بر این پیش فرض مبنی است که پروتئین‌های افراد مختلف، جمعیت‌های مختلف، گونه‌های مختلف و غیره در صورت داشتن حرکت یکسان در داخل یک ژل مشابه‌اند و پس از رنگ‌آمیزی تولید باند‌هایی با عرض و شدت نسبتا یکسان می‌نمایند. هر یک از باندها به عنوان صفتی مجزا مورد بررسی قرار می‌گیرند و فرض بر این است که این صفات فرآورده‌های نسبتا مستقیم ژن می‌باشند. روش عمومی برای ارزیابی تشابهات پروتئین در میان جمعیت‌ها، اکسون‌ها و غیره بکار گرفتن نوعی معیار شباهت است (رحیمی‌نژاد، 1378)‏. شمارش ساده نسبت a/b که در آن a نشانگر تعداد باندهای مشترک وb تعدادکل باند‌های یافت شده در دو جمعیت، تاکسون و غیره است، روش مرسوم برای نشان دادن شباهت پروتئینی است. باید به این نکته اشاره کرد که این روش منجر به برآوردی از فاصله ژنتیکی نمی‌گردد (Sahai و Rana، 1977)‏. گاهی مخلوطی از عصاره‌های پروتئینی مربوط به دو تاکسون به منظور ارزیابی این که آیا باندها جدا می‌شوند یا مهاجرت شانه به شانه دارند با یکدیگر و بطور مخلوط در جریان قرار می‌گیرند. این روش ممکن است امکان ارزیابی خالص‌تر شانه به شانه را در مقایسه با در جریان قرار دادن عصاره‌های مجزا و به صورت بغل به بغل در یک قالب ژن فراهم آورد (رحیمی نژاد، 1378)‏. گسترده‌ترین تکنیک مورد استفاده برای آنالیز پروتئین‌های مخلوط SDS-PAGE (ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی‌اکریل‌آمید) است. پروتئین‌ها براساس اندازه آنها جدا می‌شوند. با کمک آنالیزSDS-PAGE پروتئین‌های محلول در آب، باندهایی با غلظت متفاوت، وزن ملکولی و تحرک نسبی متفاوت گزارش شده‌اند (Shehata، 2004)‏.
از روشSDS-PAGE برای مقایسه الگوی پروتئین گلوبولین و آلبومین در واریته جو دو سر استفاده شد و به عنوان یک روش برای شناسایی واریته‌های جو دو سر عنوان گردید (Dvoracek و همکاران، 2003)‏.
2-3-6 مدل‌های آماری برآورد تنوع
اختلاف در دامنه تظاهر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک در نتیجه تنوع ژنتیکی است. تجزیه و تحلیل‌های چند متغیره به عنوان ابزار کارایی در برآورد تنوع ژنتیکی، تعیین سهم هر صفت از تنوع کل، طبقه‌بندی جوامع بیولوژیک و شناخت فاکتورهای موثر در تنوع ژنتیکی به کار می‌رود. (Batrual و همکاران، 1985)‏.
تجزیه خوشه‌ای: تجزیه کلاستر یکی از روشهای آماری چند متغیره و غیر پارامتری است. هدف از این نوع تجزیه آن است که افراد یک جامعه یا نمونه حاصل از افراد یک جامعه را براساس اطلاعات p صفت در داخل گروه‌های مختلف قرار بدهیم. بطوری که افراد هم گروه از لحاظ p صفت مورد نظر بسیار به هم شبیه و افراد در گروه‌های متفاوت از لحاظ این صفات تفاوت بیشتری داشته باشند. برای سنجش تشابه یا تفاوت افراد باید معیارهای تشابه و معیار عدم تشابه یا فاصله تعریف شود. پس از تعیین معیار تشابه یا عدم تشابه باید مکانیسمی تعریف شود که نحوه تشکیل گروه‌هایی از افراد تشابه را نشان دهد. بنابراین تجزیه کلاستر شامل دو مرحله است شامل: