مقاله با موضوع نگهداری و موقعیت

دانلود پایان نامه

ml50 اسیداستیک و ml200متانول را با یکدیگر مخلوط نموده سپس حجم آن با آب مقطر به ml500 رسانده شد. این محلول در دمای آزمایشگاه قابل نگهداری است.


د: طرز تهیه ژل صفحه‌ای عمودی
صفحات شیشه‌ای را کاملا تمیز کرده فاصله اندازه‌ها را با توجه به ضخامت مورد نیاز
ژل انتخاب شد. و بین صفحات شیشه‌ای قرار داده شد. قالب شیشه‌ای را با چند گیره محکم کرده، بخاطر احتمال نشت محلول ژل از حد فاصل شیشه‌ها و فاصله اندازه‌ها، با استفاده از وازلین شیشه‌ها را از بیرون کاملا آب‌بندی می‌نماییم تا محلول خارج نشود و با آب مقطر بررسی می‌کنیم‏.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده)، مواد مورد استفاده در ژل پایین شامل بافر ژل پایین، محلول استوک اکریل‌آمید، پرسولفات‌آمونیم وTEMED می‌باشد. مقدار مورد نیاز از هر یک را برداشته با هم مخلوط می‌کنیم البته بجز تمد که آخرین مواد ماست که به محلول اضافه می‌کنیم و پس از هم زدن به سرعت و دقت در قالب شیشه‌ای تا ارتفاع مناسب ریخته، بطوری که 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی بماند. انعقاد ژل پایین معمولا 45-15 دقیقه طول می‌کشد. بعد از انعقاد ژل پایین نوبت به ژل بالا می‌رسد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده)، مواد مورد استفاده در ژل بالا شامل بافر ژل بالا، محلول استوک اکریل‌آمید، پرسولفات آمونیم 10 درصد و TEMED می‌باشد. اجزای ژل بالا غیر از تمد در ظرف مناسبی مخلوط شده و خوب هم می‌زنیم در آخر تمد را اضافه می‌کنیم و پس از هم زدن سریعا تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته، سپس شانه را در ژل بالا فرو برده بطوریکه دندانه‌های آن حدود 5/1 cm ازسطح ژل پایین فاصله داشته باشد. ژل بالا معمولا در کمتر از 15 دقیقه منعقد می‌شود (کناره دندانه‌های شانه از ژل منعقد شده قابل تشخیص است)‏.
شانه و فاصله ‌انداز پایین را از حد فاصل شیشه‌ها خارج کرده هر گونه ژل اضافی یا محلول منعقد نشده درون چاهک یا انتهای ژل را با تزریق بافر الکترود خارج کرده و قالب شیشه‌ای را به تانک الکتروفورز متصل نموده، مخازن تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر شد اگر موقعیت چاهک‌ها مشخص نباشد، ممکن است نمونه‌گذاری به طور صحیح صورت نگیرد یا ته چاهک‌ها در اثر فرورفتن نوک وسیله نمونه‌گذاری دچار آسیب گردد. راه دیگر تشخیص چاهک‌ها، افزودن یک قطره محلول بروموفنل بلو به محلول ژل بالا در هنگام تهیه آن است. در این حالت ژل بالا به رنگ آبی روشن در می‌آید. هر گونه حباب هوا در انتهای ژل با تزریق بافر توسط سرنگ خارج می گردد.
از نمونه‌های پروتئین آماده شده با کمک سمپلر به میزان مناسب با غلظت پروتئین یکسان به دقت در چاهک‌ها ریخته شد. به دلیل وجود گلیسرول، نمونه در ته چاهک قرار می‌گیرد. مقدار پروتئین لازم در هر چاهک بستگی به میزان خلوص نمونه و روش رنگ آمیزی دارد.
کابل‌ها را به الکترودهای مربوطه وصل نموده، برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 30-20 میلی آمپر مناسب است. در این حالت رنگ نشانگر (برموفنل بلو) در عرض 5/2-5/1 انتهای ژل می‌رسد. به علت اینکه احتمال حرکت معادل یا سریع‌تر بعضی از اجزای نمونه نسبت به رنگ نشانگر وجود داشت، جریان برق را قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع گردید.
بعد از قطع جریان، قالب شیشه‌ای را از تانک جدا کرده و آن را در کف دست قرار داده و با فرو بردن یک فاصله اندازه به حد فاصل شیشه‌ها و حرکت آرام آن، شیشه بالا را برداشته، ژل بالا را با لبه یکی از فاصله اندازه‌ها قطع کرده و دور ریخته شد. و ژل پایین را نگاه می‌داریم‏.
3-5 نکات:
برای قرار دادن قالب شیشه‌ای در تانک الکتروفورز عمودی همچون تانک‌های ساخت داخل، بهتر است ابتدا مخزن پایین را تا ارتفاع مناسب از بافر پرکرده سپس قالب شیشه‌ای رابه طور مایل از یک گوشه به آرامی وارد بافر نمایید. در این حالت حبابی در انتهای ژل وارد نمی‌شود‏.درصورت ورود حباب هوا به انتهای ژل، قالب را خارج نموده با بافر الکترود یا آب مقطر حباب‌های ته ژل را خارج کنید سپس عمل بالا را تکرار کنید.
درصورتی که پروتئین در ژل بالا یا ابتدای ژل پایین مانده باشد، بهتر است ژل بالا جدا نشود و همراه بقیه ژل رنگ‌آمیزی شود.
3-5-1 رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها و رنگ زدایی ژل
الف: روش رنگ‌آمیزی با آبی‌کوماسی
بعد از جدا کردن ژل از شیشه، ژل را داخل فیکساتور قرار می‌دهیم به مدت نیم ساعت روی شیکر باشد. بعد ژل را خارج کرده با آب مقطر می‌شوییم و داخل ظرف شیشه‌ای یا پلاستیکی درب‌دار قرار می‌دهیم روی آن مقدار کافی از محلول رنگ‌آمیزی (ml 100) بر روی آن اضافه می‌کنیم‏.درب ظرف را بسته به مدت یک ساعت داخل آون قرار می‌دهیم و یا چند ساعت آن را روی شیکر قرار می‌دهیم. این مدت برای رنگ‌آمیزی ژل کافی است.
ب: رنگ بری ژل
پس از تخلیه محلول رنگ، ژل با آب مقطر کاملاً شستشو یافت و محلول رنگ برI به اندازه 100ml برروی ژل اضافه شد سپس ظرف درب دار روی شیکر با حرکت آرام به مدت یک ساعت قرار داده شد آن وقت ژل را از رنگبر I بیرون آورده و مجدداً با آب مقطر شسته و آن را درون محلول رنگبر II که رقیق تر قرار می‌دهیم و به مدت یک ساعت روی شیکر با حرکت آرام قرار داده و ژل به مدت یک شب درون رنگبر II می‌ماند پس از تیره شدن محلول رنگبر II،آن با محلول تازه جایگزین می‌گردد و این عمل چندین بارتکرار یافت تا زمینه ژل پس از چند روز شفاف گردید و باندهای پروتئینی به وضوح دیده شدند.
ج: نگهداری ژل